Le Professeur Layton est reconnu pour être un grand gentleman mais aussi un amateur d'énigmes en tout genre.
Lorsqu'il reçoit une lettre assez inquiétante d'une de ses anciennes élèves devenue cantatrice Janice Quatlane, lui avouant que l'esprit de son amie défunte (Mélina) s'est réincarnée dans le corps d'une petite fille, il n'eut aucune hésitation et partit avec son jeune disciple Luke Triton à la conquête de ce nouveau mystère.
Tout deux fûrent alors invités à la représentation de Janice au Crown Petone, où se déroule le nouvel Opéra d'un certain Oswald Whistler qui met en scène la légende de la Diva Éternelle et de son royaume d'Ambrosia. Mais lorsque le rideau se ferme sur la prestation de Janice, un homme étrange apparaît et propose un petit jeu où il promet au vainqueur le don de la vie éternelle.Le Professeur Layton et Luke devront non seulement résoudre le mystère confié par Janice mais aussi le mystère qui se cache derrière cette soit-disante Vie Éternelle.
